ПВТ HBV+HDV

[MapaT]

EASL 2016, JOURNAL OF HEPATOLOGY:

Технология количественного определения HBsAg

Первое сообщение о стандартизованном количествен-
ном определении HBsAg в единицах массы на объем по-
явилось более 40 лет назад [22]. В последние годы разра-
ботан ряд методов количественного определения HBsAg,
соответствующих требованиям для биомаркера, т. е. обе-
спечивающих воспроизводимость результатов и автома-
тическую количественную оценку в стандартных МЕ/мл
при относительно низкой стоимости. Ценно то, что они
выявляют все три формы циркулирующего HBsAg, коди-
руемые мини-хромосомой (HBV, сферическими и ните-
видными SVP), и HBsAg, кодируемый интегрированной
ДНК HBV. В иммуноферментном анализе используют ан-
титела к отдельным консервативным эпитопам белка S,
обычно его детерминанте «a», не дифференцируя под-
типы и происхождение белка HBsAg. В продаже имеется
по крайней мере три тест-системы для количественного
определения HBsAg: Architect QT (Abbott Labories),
Elecsys HBsAg II Quant (Roche Diagnostic) и DiaSorin
Liaison XL. Все три системы прошли оценку во многих
клинических исследованиях и дают близкие результаты
[23–25]. Пределы уровня при определении Architect со-
ставляют 0,05–250 МЕ/мл, Elecsys II — 0,05–130 МЕ/мл,
Liaison XL — 0,03–150 МЕ/мл [23]. Все три системы име-
ют широкую автоматическую панель разведения, обыч-
но 1:400, за счет чего верхний предел количественного
определения превышает 50 000 МЕ/мл.
Следует иметь в виду, что на результаты количествен-
ного определения HBsAg влияют некоторые факторы.
Например, оно становится неточным или недостоверным
при преобладании штаммов вируса с мутациями лекар-
ственной устойчивости [26]. Кроме того, HBsAg нередко
частично маскируется в иммунных комплексах, что может
влиять на результаты [27].
Как сказано выше, имеющиеся в настоящее время в
продаже системы количественного определения HBsAg
не в состоянии дифференцировать каждый из трех его
подтипов. Выполняется несколько исследований пригод-
ности поверхностных белков HBV в качестве биомарке-
ров и возможности получить на основании их определе-
ния более обширную информацию, чем предоставляют
существующие коммерческие тест-системы. Пока эти
системы опираются на количественный твердофазный
иммуноферментный анализ или вестерн-блоттинг, ис-
пользующий моноклональные антитела против домена S
(для определения уровня всех поверхностных белков
HBV), домена preS1 (для определения уровня белка L) и
N-гликозилированного домена preS2 (для определения
поверхностного белка M) [28].

[Himik36]

Спасибо за разъяснение. Очень актуально! Не все еще ,конечно, понятно, но будем разбираться

[MapaT]

Дополнение к посту: viewtopic.php?f=33&t=21448&start=210#p1403045 для полноты картины.

Вирион HBV:

Вирион HDV:


Упрощенная схема инфекционного цикла HBV (HBV - моноинфекция):

[img]http://s16.radikal.ru/i190/1710/e5/5d6e77df100b.jpg[/img]

(1) Прикрепление к гепатоциту через специфические рецепторы входа NTCP на его поверхности.
(2) Высвобождение нуклеокапсида в цитоплазму гепатоцита.
(3) Перенос RC-ДНК в ядро клетки.
(4) Конверсия RC-ДНК до ковалентно замкнутой кольцевой ДНК (сссDNA) .
(5) Транскрипция* с cccDNA вирусных РНК: прегеномной РНК и нескольких мРНК.
(6) Экспорт вирусных РНК в цитоплазму клетки.
(7) Прегеномная РНК транслирует* коровые белки (Core) и ДНК-полимеразу.
(8) Упаковка молекул полимеразы, коровых белков и прегеномной РНК во вновь образующиеся нуклеокапсиды.
(9)Образование двуцепочечной ДНК на основании информации одноцепочной РНК с помощью полимеразы HBV. Данный процесс называется обратной транскрипцией*, приводящий к образованию новой RC-ДНК. - в этот этап репликации можно вмешаться при помощи аналогов нуклеотидов (TDF,TAF), которые ингибируют процесс обратной транскрипции (РНК в ДНК), прерывая цикл. Либо при помощи аналогов нуклеозидов (энтекавира трифосфата), который ингибирует все 3 функциональные активности вирусной полимеразы.
(10) мРНК, содержащая ген X кодирует белок HBx, который является активатором транскрипции* cccDNA, предотвращая ее "молчание".
(11) Трансляция* белков поверхностных антигенов (HBsAg) на матрицах мРНК (pre-S1 и pre-S2) и избыточных субвирусных частиц (SVP), составляющих основную часть поверхностного антигена гепатита В. Секретируются: L-HBsAg (большой); M-HBsAg (средний); S-HBsAg (малый);
(12) Окончательная сборка и выход новых вирионов за пределы клетки осуществляется с помощью компонентов мультивезикулярного тельца (MVB).

Часть капсидов с RC-ДНК еще до окончательного завершения формирования капсида возвращаются в ядро и превращаются в ковалентно замкнутую кольцевую ДНК, пополняя тем самым ее пул. Это поддерживает непрерывность инфеционного процесса.

На шаблоне прегеномной РНК, находящейся уже в капсиде иногда может синтезироваться еще один вид ДНК – линейная двухцепочная. Если такой капсид попадет в ядро клетки, то возможна интеграция случайной последовательности ДНК в геном гепатоцита, обычно это участок pre-S/S (который секретирует HBsAg).




Упрощенная схема инфекционного цикла HDV+HBV (HBV+HDV Коинфекция, суперинфекция):
Слишком грубо и без некоторых деталей, но все-же



(1) Прикрепление к гепатоциту через специфические рецепторы входа NTCP на его поверхности.
(2) Высвобождение генома HDV и дельта-антигена в цитоплазму гепатоцита.
(3) HDAg транслоцирует вирусный геном в ядро.
(4) РНК полимераза II и I запускают репликацию вирусного генома. *В отличие от других вирусов-сателлитов, HDV не использует полимеразу хелперного вируса (то есть вируса, только в присутствии которого возможно образование вирионов HDV), а потому целиком полагается на ферменты клетки-хозяина. Имеется ряд доказательств того, что в репликации HDV участвует РНК-полимераза II*
(5) Процесс репликации начинается с транскрипции антигеномной РНК (с матричной РНК HDV), запускается механизм двойной репликации по типу катящегося кольца.
*Поскольку геномная РНК HDV имеет отрицательную полярность, во время репликации производятся три разные формы РНК: кольцевая геномная РНК, кольцевая комплементарная антигеномная РНК и линейная антигеномная РНК. Механизм двойной репликации по типу катящегося кольца включает однонаправленную репликацию нуклеиновых кислот с образованием множественных копий генома*
(6) В процессе репликации транскрибируется (см. транскрипция) полноразмерная геномная РНК HDV.
(7) Антигеномная РНК в процессе репликации транскрибирует(см. транскрипция) мРНК в цитоплазму клетки.
(8) мРНК запускает трансляцию вирусных протеинов: L-HDAg и S-HDAg.
(9) HDAg содержит различные функциональные области, одна из которых - РНК-связывающий домен, это дает возможность сборки частиц в некое подобие незрелого нуклеокапсида.
(10) L-HDAg содержит еще несколько доменов, один из которых включает в себя -сигнал сборки вируса (VAS). Он специфически связывается с областью pre-S/S протеина HBsAg, завершая тем самым формирование частицы. *Относительно сборки частиц HDV и их выхода из клетки существует много вопросов, не имеющих ответа. В отличие от HBV, для высвобождения частиц которого необходим цитоплазматический домен HBsAg, включающий соединительный участок между PreS1 и PreS2, HDV в этом не нуждается.
Для формирования оболочки вокруг рибонуклеопротеина HDV необходимо фарнезилирование C-концевого участка L-HDAg, поскольку оно управляет взаимодействием с S-участком HBsAg. Фарнезилирование включает прикрепление цепочки из 15 атомов углерода к мотиву C211XXQ-бокс, присутствующему на C-конце L-HDAg и консервативному среди всех генотипов HDV*
(11) HDV, по видимому, использует преимущественно путь высвобождения субвирусных частиц через аппарат Гольджи, а не через мультивезикулярное тельце, как HBV.



Сноски:

Реплика́ция (от лат. replicatio — возобновление) — процесс синтеза дочерней молекулы рибонуклеиновой кислоты на матрице родительской молекулы.

Транскри́пция (от лат. transcriptio — переписывание) — процесс синтеза РНК с использованием ДНК в качестве матрицы или наборот.


Трансля́ция (от лат. translatio — перенос, перемещение) — процесс синтеза белка из аминокислот на матрице информационной (матричной) РНК (иРНК, мРНК), осуществляемый рибосомой.

(Примерно так должен выглядеть синтез белков, вирусных в том числе)


(https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%92%D0 ... 1%82%D0%B0 )
(https://www.wjgnet.com/1948-5182/full/v5/i12/666.htm )
( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ )

[MapaT]

HDV, если можно так выразиться, слишком прост по своей структуре, его геном мал и состоит из РНК и двух родственных по структуре антигенов, сильно ограничивая при этом потенциальные мишени для создания Anti-HDV препаратов. В процессе репликации HDV не использует ни своих собственных ферментов ни даже ферментов вируса сателлита, целиком и полноcтью полагаясь на ферменты клетки-хозяина.

Поскольку HDV ограничен способностью кодировать дополнительные белки, он транслирует только один HDAg с двумя изоформами, таким образом, использует клеточное оборудование хозяина (клеточные белки) для выполнения процессов, которые необходимы для его жизненного цикла, такие как транскрипция, репликация, транскрипционных и трансляционных модификаций [ 9 , 12 ].

Очевидно, что HBV не играет никакой роли в репликации HDV и ограниченная инфекция может протекать даже при отсутствии вспомогательного вируса в клетке. Единственным условием для распространения инфекции является наличие экспрессии HBsAg в клетке ко-инфицированной HBV.


Во время инфекции происходит передача сигналов IFN-α зараженными вирусом клетками, чтобы предупредить соседние клетки о наличии вируса, этот механизм является первой линией защиты хозяина для уничтожения патогена, но к HDV это мало относится, особенно при ХГD:

Патогенез HDV включает ингибирование межклеточной передачи интерферона-α (IFN-α) [ 50 ], активацию Т-лимфоцитов для HDV- специфического ответа, а так же производство цитокинов [ 51 , 52 , 53 ], факторов некроза опухолей-альфа (TNF-α)

Уже установлено, что патогенез повреждения печени при инфекции HDV не является непосредственно цитопатическим, но, как известно, задействованы механизмы, обусловленные иммунной системой.

Экзогенные антигены и неинфекционные вирусные частицы эндоцитируются окружающими антиген - представляющими иммунными клетками (которые включают в себя макрофаги, В-лимфоциты и дендритные клетки), они представляют антигены на их поверхности. CD4 +хелперные Т-клетки распознают антигены, таким образом активируется вирус-специфический клон хелперных Т-клеток и начинает размножаться, чтобы очистить вирусную инфекцию. Пролиферирующие хелперные Т-клетки подразделяются на три подтипа: тип 0 (Th-0), Th-1 и Th-2 T-клетки на основе их функций и продуцируемых ими цитокинов. Таким образом, специфический к HDV активированный клон вспомогательной Т-клетки является ключевым компонентом, вокруг которого вращается патогенез HDV [ 52 ].

[MapaT]

Reduction of covalently closed circular DNA with long-term nucleos(t)ide analogue treatment in chronic hepatitis B.
J Hepatol. 2017 Feb;66(2):275-281. doi: 10.1016/j.jhep.2016.08.022. Epub 2016 Sep 14.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27639844

Из 129 пациентов, которые были зарегистрированы в международных клинических испытаниях аналогов нуклеозидов (тидов) и которые имели результаты биопсии печени на начало исследования, через год после лечения, были завербованы (43 пациента) на длительное непрерывное лечение в течении 72-145 месяцев с последующим проведением третьей биопсии печени.
Были исследованы ДНК HBV в сыворотке крови, уровень поверхностного антигена гепатита B (HBsAg), общая внутрипеченочная ДНК HBV, cccDNA, прегеномная РНК HBV (pgRNA), а также гистологические изменения.

РЕЗУЛЬТАТЫ:
После проведения 3 биопсии уровни ДНК HBV в сыворотке были необнаружимыми у всех пациентов, кроме одного. Медианные уровни HBsAg, ihHBV ДНК и cccDNA составляли 2,88 logIU / ml, 0.03 copies / cell и 0.01 copies / cell, соответственно. По сравнению с исходными уровнями было отмечено снижение уровней HBsAg на 0,54 log (71,46%), уровни ДНК ihHBV на 2,81 log (99,84%) и уровни cccDNA на 2,94 log (99,89%), причем 49% имели уровни cccDNA ниже предела обнаружения. У одного пациента был необнаруживаемый HBsAg. Средний уровень pgRNA, измеренный только в третьей биопсии, составлял 0,021 копий / клетку, причем 40% пациентов имели неопределяемую pgRNA.

ВЫВОДЫ:
Долгосрочная терапия на основе аналогов нуклеозидов (тидов) индуцировала заметное истощение cccDNA у большинства пациентов, тогда как уровни HBsAg в сыворотке, хотя и уменьшались, но были обнаружены у всех пациентов, кроме одного. Является ли истощение cccDNA устойчивым и связано ли это с улучшением долгосрочных результатов для пациента, требует дальнейшего изучения.

РЕЗЮМЕ:
Как правило, противовирусная терапия не позволяет добится уменьшения ДНК вируса гепатита B, называемой ковалентно замкнутой кольцевой ДНК (cccDNA), которая скрывается внутри ядер клеток печени пациентов с хроническим гепатитом B. Настоящее исследование показало, что при длительном лечении (средний период 126 месяцев), cccDNA может быть заметно снижена, причем 49% по результатам биопсий печени имеют неопределяемую cccDNA. Это говорит о том, что способность вируса к репликации будет очень низкой после длительного противовирусного лечения.

Development of a Novel Site-Specific Pegylated Interferon Beta for Antiviral Therapy of Chronic Hepatitis B Virus.
Antimicrob Agents Chemother. 2017 May 24;61(6). pii: e00183-17. doi: 10.1128/AAC.00183-17. Print 2017 Jun.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28373196
Недавно был разработан новый специфичный пэгилированный рекомбинантный человеческий IFN- β (TRK-560). В настоящем исследовании мы оценили противовирусные эффекты TRK-560 на репликацию HBV in vitro и in vivo.

Модели репликации HBV обрабатывали антивирусными препаратами, включая TRK-560, и оценивали изменения маркеров HBV. TRK-560 значительно подавил продукцию внутриклеточных интерферентов репликации HBV и экспрессию поверхностного антигена HBV (HBsAg) ( P <0,001 и P <0,001 соответственно), а противовирусные эффекты TRK-560 были увеличены в комбинации с нуклеотидными аналогами, такие как энтекавир и тенофовир дизопроксил фумарат.

Снижение уровня ДНК HBV с помощью TRK-560 было значительно выше, чем при использовании PEG- IFN -α2a как in vitro, так и in vivo ( P= 0,004 и P = 0,046 соответственно), снижение внутриклеточной ковалентно замкнутой кольцевой ДНК (cccDNA) после обработки TRK-560 также было значительно лучше, чем при лечении PEG- IFN -α2a in vivo ( P = 0,0495).

TRK-560 демонстрирует более сильную противовирусную активность посредством более высокой индукции генов, стимулированных интерферонами, и более сильной стимуляции хемотаксиса иммунных клеток, чем PEG- IFN-α2a. Поскольку клиренс HBsAg и эрадикация ксДНК HBV являются важными клиническими целями, эти результаты указывают на потенциальную роль TRK-560 в развитии более эффективного лечения хронической инфекции гепатита B.

[samantal]

Средний период лечения 126 мес, это 10,5 лет. Как с этим увязывать попытки прерывания ПВТ через 3-5 лет?

[MapaT]

samantal
А почему обязательно нужно увязывать ?) У этого исследования были другие задачи.

[Геннадий82]

Спасибо Марат, за очень хорошие новости! Может и не потребуется вовсе большая синяя таблетка, cccDNA сам по себе видимо дохнет при постепенном отмирании гепатоцитов, если при этом не давать вирусу размножаться. Я помню вопрос на тему выживания cccDNA при обновлении клеток печени вызывал бурные дискуссии. Теперь мы видим, что не так уж и просто вирусу заражать новые гепатоциты и выживать в печени при приёме АН.

[MapaT]

Геннадий82
Что касается увеличения пула cccDNA - это да, становится затруднительно для вируса из-за длительного блокирования репликации и соответственно сборки-выхода вирионов. Как показано в исследовании, количество может снижается практически до необнаруживаемых уровней (но при очень длительной терапии )

Но при всем при этом, транскрипция генома может продолжаться, соответственно продолжается экспрессия HBsAg и других продуктов его жизнедеятельности. Т.е АН затронут только этап обратной транскрипции - когда вирусная прегеномная РНК превращается обратно в ДНК в нуклеокапсиде.

К тому же, у HBeAg-отрицательных основной матрицей для производства HBsAg - является не cccDNA, а клетки печени в чей геном интегрирована последовательность ДНК (участок pre-S/S).

ПО идее, если со временем происходит обновление гепатоцитов, то рано или поздно печень должна была бы "очистится" от этого, пусть даже спустя 20 лет приема АН Но, по видимому, этого не происходит ))

Может быть, новые клетки, появившиеся в процессе деления (либо созревания из стволовых клеток) уже содержат последовательность вирусной ДНК (на основании предшественников), что и обуславливает носительство HBsAg - это чисто теория, но кажется логичной

[gopher60]

1/43 шанс на клиренс HBsAg ... Чето както маловато ?

1/43 случай не подавленной HBV DNA похоже на правду. Но это печально

В целом недостаточно сведений о группе 43-126 ...

Ну и радует, что ни одного "холодного"

Даже под трамвай никто не попал

[MapaT]

gopher60
Клиренс HBsAg на нуках ? Это что-то из области фантастики )
Вероятность болтается где то на уровне 0-1%)

В целом недостаточно сведений о группе 43-126 ...

Можно получить полный доступ к тексту исследования через http://www.sci-hub.io , введя DOI: 10.1016/j.jhep.2016.08.022. (или http://sci-hub.io/10.1016/j.jhep.2016.08.022 )

[gopher60]

Вот чего я не понимаю - так это "качелей" ...

То приводят данные на форуме о 5 и даже 7 % сероконверсии HBsAg при длительной терапии АН. Причём после ОТМЕНЫ !

То "Клиренс ...из области фантастики"...

Я конечно не претендую

Но пора бы нам уже определиться : " Ты за большевиков али за коммунистов ? " (с)

ЗЫ. Или Вы имели ввиду клиренс - который КЛИРЕНС ? 160 мм , если ЧО

(у моей "Калинки")

[MapaT]

gopher60
Откуда эти данные ?
7% для HBe-негативных или для HBe-позитивных ? Это принципиально важно

При терапии пегилированным интерфероном вероятность клиренса по разным данным 7-10%.
На терапии АН она СТРЕМИТСЯ к 0 у HBe-негативных.

Вообще, в разных исследованиях приводятся разные данные и с этого следовало начать.

Может быть Вы все-таки имеете ввиду HBeAg-позитивных ?
В таком случае будет 3-4% для 48-52 недель и 10-12% для 5-8 лет терапии АН. В принципе, что там, что здесь - ничтожно мало, но в случае HBe-негативных - еще меньше ( около 0.)

Вот данные EASL 2017 (тут от 48 до 52 недель):

Еще выдержка из того же документа (другие сроки - от 5 до 8 лет):

Loss of HBsAg during long-term NA therapy
may occur in a minority of CHB patients who were initially
HBeAg-positive (approximately 10–12% after 5–8 years of therapy)
while is rare in patients with HBeAg-negative CHB (1–2% after 5–8 years of therapy).

Потеря HBsAg во время длительной терапии NA может произойти у не большого числа пациентов с ХГВ, которые изначально были HBeAg-положительными (приблизительно 10-12% после 5-8 лет терапии),в то время как у пациентов с HBeAg-отрицательным ХГВ (1-2% после 5-8 лет терапии).

Из того самого исследования:

11 пациентов имели HBV генотип B, 32 имели генотип C. В начале исследования 23 пациента были положительными по HBeAg, 20 анти-HBe - положительными.
На момент проведения третьей биопсии 4 остались положительными по HBeAg, 9 были отрицательными как для HBeAg, так и для анти-HBe, и 29 были положительными для анти-HBe. Один пациент, положительный по анти-HBe на исходном уровне, потерял HBsAg после 68 месяцев лечения.

Вот так, имевший самый низкий % на клиренс (HBe-негативный) в итоге стал HBsAg отрицательным, везунчик

P.S С вопросами клиренсов вроде разобрались, теперь За замечание относительно недостаточности данных - понял, учту. Придется в следующий раз писать многабукаф

Если просматривать через Sci-Hub - то там отсутствует автоматический перевод, что доставляет некоторые неудобства...

[gopher60]

Только нас вдохновил KWIC

viewtopic.php?f=2&t=21089&start=30

как тут же спустил на землю МараТ

На ум ничего не приходит, кроме последовательности "баня-еврей-крестик-трусы"

ЗЫ. МараТ, многабукаф не надо, спасибо Вам за ТВОЙ ( это я чтобы подчеркнуть искреннее уважение !) труд.

[MapaT]

Только нас вдохновил KWIC

viewtopic.php?f=2&t=21089&start=30

как тут же спустил на землю МараТ

Ну почему, вполне может иметь место, не спорю ))

Я например видел исследование PegIFN-a2b + адефовир, где 17% достигли клиренса HBsAg, но в целом, это не означает, что 17% пациентов в другом исследовании непременно достигнут этого же результата.. Тут решает большая выборка. Можно высчитать 17%, 19% и 40%, из 10 респондентов Надо смотреть в целом.
Кстати, я не в курсе, откуда в EASL берут "свои" % ))