Исследования в лечении гепатита B

[kargyraa]

Днк вируса в крови, и днк вируса в клетках печени это же разные вещи?

Разные.

А как определяют нагрузку вируса внутри печени?

ПЦР ДНК ВГВ из биоптата.

[Scrooge805]

Разные

а есть ли какая нибудь интерполированная закономерность hbv биоптата в зависимости от hbs ag, dna в крови, и может быть каких то ферментных показателей?

[kargyraa]

Scrooge805, ПЦР ДНК ВГВ (кол-во частиц Дейна) что в сыворотке крови, что в биоптате печени никак не зависит от HBsAg.
Есть определённая взаимосвязь между кол-вом частиц Дейна в сыворотке и в биоптате, но, насколько я знаю, эта связь не описывается фиксированной формулой: ПЦР ДНК что по сыворотке крови, что из биоптата печени имеет самостоятельную диагностическую ценность - биоптат печени и сыворотка крови не взаимозаменимы.
А ферментные показатели вообще ни при чём.

[rodon]

ПЦР ДНК ВГВ (кол-во частиц Дейна)

Мне кажется кол-во ДНК ВГВ, измеряемое методом ПЦР, и вирионы HBV (частицы Дейна), это все-таки разные понятия.
Или я ошибаюсь?

[smilla]

Частица Дейна - это весь вирион, ДНК - его составляющая. ПЦР ДНК считает определенные фрагменты ДНК, что соответствует подсчету количества вирионов в крови. Я так понимаю эту кухню.

[rodon]

smilla, я не вникал сильно в эту тему, но мне всегда казалось,
что кол-во днк HBV в крови, это кол-во именно самих ДНК, которые там "плавают" подобно "шелухе" HBsAg,
а тот ДНК, что находится внутри вириона, он покрыт оболочкой капсида, и его подсчет невозможен, как и кол-ва самих вирионов в крови.
Поэтому и начал задавать эти вопросы. Хотелось бы еще мнений. )

[Костян40]

ВГВ (частица Дейна) - сферическая частица диаметром 42 нм, состоит из ядра - нуклеоида, имеющего форму икосаэдра диаметром 28 нм, внутри которого находится двуцепочечная ДНК, концевой белок и фермент ДНК-полимераза. В состав нуклеоидного белка - HBcAg входит HBeAg. Внешняя оболочка (толщиной 7 нм) образована поверхностным антигеном вируса гепатита В - HBsAg

Я как понимаю, считают то, что подчеркнул. И это соответствует самому количеству вирионов

[smilla]

Хотелось бы еще мнений.

Всё же отвечу. Те вирионы, что уже встроились в гепатоциты и не только (фаза интеграции) - их ДНК можно посчитать только усредненно на биопсийных срезах (методом ПЦР кол.). Остальные плавают в кровяном русле и их ДНК подсчитывается после экстракции (выделения) - одного из этапов метода ПЦР.

[rodon]

Я имел ввиду кол-во вирионов только в крови.

Вот еще мысли на счет моей точки зрения, что кол-во ДНК HBV в крови не тождественно кол-ву вирионов HBV, хотя кол-во ДНК HBV в крови коррелирует с репликционной активностью HBV, а значит существует корреляция между кол-вом ДНК HBV и кол-вом вирионов .

В последнее время появились исследования по подсчету не ДНК HBV в крови, а РНК HBV
/несмотря на то, что вирус гепатита B является ДНК-содержащим вирусом, в его жизненном цикле имеется РНК-стадия/.

Моих знаний не достаточно для понимания всей этой кухни, но во втором исследовании есть вот интересный такой момент
"Чтобы увидеть, присутствует ли РНК HBV в сыворотке в частицах, амплификацию проводили с применением расщепления РНКазой, примененной либо непосредственно к сыворотке, либо после экстракции нуклеиновой кислоты в приборе MagNA Pure (т.е. после лизиса вирусных оболочек и капсидов)."

"Обработка РНКазой, примененная до экстракции нуклеиновой кислоты, не оказала существенного влияния (значение Ct увеличилось на 0,3 цикла), тогда как обработка РНКазой после экстракции нуклеиновой кислотой удалила почти всю РНК HBV. Эти результаты свидетельствуют о том, что в сыворотке практически не было свободно циркулирующей РНК HBV. "

В общем мой вопрос по прежнему таков - в обычных лабах методом ПЦР измеряют "свободно циркулирующую" в крови ДНК HBV, или все таки ту, что находится внутри капсида вирионов HBV. Я до настоящего момента считал, что измеряют "свободно циркулирующую", которая попадает в кровь в процессе репликации вируса, как и полноценные вирионы, шелуха HBsAg, антиген HBeAg и т.п.

Давайте еще мнения.


Исследования,

Исследование 1

https://jcm.asm.org/content/55/10/2972
ДНК, РНК и HBsAg вируса гепатита Б в сыворотке крови: что лучше коррелирует с внутрипеченочной ковалентно замкнутой кольцевой ДНК до и после НА-терапии?

Хотя доступные в настоящее время противовирусные препараты могут эффективно снижать уровни ДНК HBV в сыворотке пациентов с ХГБ, HBV может не удаляться из-за персистенции ковалентно замкнутой кольцевой ДНК (cccDNA) HBV в инфицированных гепатоцитах, которая представляет собой ключевой репликативный промежуточный продукт HBV (2). Фундаментальная роль внутрипеченочной cccDNA заключается в том, что она является шаблоном для транскрипции всех вирусных РНК, включая прегеномную РНК (pgRNA), которая в дальнейшем продуцирует ДНК вириона потомства (2). Таким образом, уровень внутрипеченочной cccDNA отражает активность репликации HBV. Кроме того, предыдущее исследование также показало, что низкий уровень внутрипеченочной cccDNA, присутствующий в конце лечения, может быть сильным предиктором устойчивого ответа на противовирусную терапию среди пациентов с ХГБ (3). Тем не менее, биопсия печени необходима для выявления внутрипеченочной cccDNA, что ограничивает ее использование в клинической практике. Поэтому было проведено много исследований для изучения неинвазивных маркеров, которые могут эффективно указывать уровень cccDNA HBV в печени (4–7).

Присутствие РНК HBV в сыворотке пациентов, инфицированных HBV, было идентифицировано еще в 1996 году, и оно может служить новым вирусным маркером для пациентов с ХГВ во время терапии нуклеоз (t) -дин-аналогом (NUC) (8–10). Однако природа и происхождение сывороточной РНК HBV оставались неясными, пока недавние исследования не подтвердили, что сывороточная РНК HBV является пгРНК и что она присутствует в вирусоподобных частицах (11). Более того, сообщалось также, что сывороточная РНК HBV связана с реакциями на пегилированный интерферон (peg-IFN) или аналог нуклеоз (t) ид (NUC) (12, 13). Поскольку сывороточная РНК HBV транскрибировалась из ккДНК, она может отражать активность ккДНК в печени (11). Используя модель мыши, Giersch et al. (14) обнаружили, что уровни РНК HBV в сыворотке коррелировали с внутрипеченочными уровнями cccDNA до лечения (r = 0,89, P <0,01), в то время как корреляции между ними не было после 2-6 недель лечения peg-IFN (r = 0,13, P = 0,73). Тем не менее, у пациентов с гепатитом B e антиген (HBeAg), положительно влияющих на ХГВ, до сих пор неясно, является ли сывороточная РНК HBV новым суррогатным маркером для внутрипеченочной cccDNA до и после лечения NUC.

Значение, представляющее снижение внутрипеченочных уровней cccDNA, представляло наилучшую корреляцию со снижением уровней HBsAg (r = 0,38, P <0,01) по сравнению со снижением в ДНК HBV (r = 0,35, P = 0,01) и РНК HBV ( r = 0,28, P <0,05), и корреляции между снижением уровней cccDNA и HBeAg не наблюдалось (r = 0,18, P = 0,19). Показана корреляция между изменениями уровней РНК HBV в сыворотке, ДНК HBV, HBsAg и HBeAg и изменениями уровней внутрипеченочной cccDNA от исходного уровня до 96 недели у пациентов с ХГВ.

В предыдущих исследованиях сообщалось, что сывороточная РНК HBV транскрибируется с внутрипеченочной cccDNA HBV и, таким образом, может быть потенциальным альтернативным маркером уровней внутрипеченочной cccDNA (8, 11, 15). Здесь мы подтвердили, что сывороточная РНК HBV является достоверным маркером, но тем не менее она уступает сывороточной ДНК HBV в отношении отражения уровня внутрипеченочной cccDNA до лечения. Кроме того, используя средний уровень HBsAg на исходном уровне в качестве порогового значения, сывороточная РНК HBV может также отражать активность внутрипеченочной cccDNA у пациентов с более высоким уровнем HBsAg до лечения (r = 0,35, P = 0,03), а корреляция не существовало у пациентов с более низким уровнем HBsAg (r = 0,20, P = 0,20).

Недавние исследования показали, что сывороточная РНК HBV была полезным маркером для безопасного прекращения терапии NUC у пациентов с ХГВ (11, 16). Например, Wang et al. (11) сообщили, что вирусный отскок произошел у всех (21/21) пациентов с положительными результатами РНК HBV в сыворотке крови в конце лечения NUC, в то время как только 25% (3/12) пациентов с отрицательными значениями РНК HBV в сыворотке крови в конце Лечение NUC показало вирусный отскок (P <0,01). Таким образом, они предположили, что уровни РНК HBV в сыворотке могут отражать присутствие и транскрипционную активность cccDNA в печени после лечения NUC (11). Однако различия в уровнях ALT, AST и HBsAg и статуса HBeAg между группами сывороточных РНК-положительных и отрицательных пациентов с HBV не анализировались. Интересно, что эксперименты на животных показали, что не было никакой корреляции между уровнями РНК HBV в сыворотке и уровнями внутрипеченочной cccDNA у HBV-инфицированных мышей после обработки peg-IFN (r = 0,13, P = 0,73) (14). В настоящем исследовании результаты РНК HBV в сыворотке были отрицательными у 37 (59,7%) пациентов после 96-недельного лечения NUC, в то время как результаты cccDNA внутри печени были положительными у всех 62 пациентов, и не было никакой корреляции между уровнями РНК HBV в сыворотке и внутрипеченочные уровни cccDNA (r = -0,08, P = 0,55), что согласуется с результатами недавнего исследования, проведенного на пациентах с ХГВ, получавших лечение NUC (17). Однако, возможно, из-за различной чувствительности обнаружения в двух исследованиях в отношении измерения уровней cccDNA, у 22,0% (9/41) пациентов были отрицательные по cccDNA результаты после лечения NUC в исследовании, о котором сообщили Wang et al. (17). И тест хи-квадрат показал, что определение сывороточной РНК HBV отражает состояние (наличие или отсутствие) внутрипеченочной cccDNA в последнем исследовании (P <0,01) (17). С другой стороны, мы обнаружили, что у пациентов с потерей HBeAg после лечения NUC был значительно более низкий уровень РНК HBV в сыворотке крови на 96 неделе, чем у пациентов без потери HBeAg (2,03 ± 0,61 log МЕ / мл против 2,67 ± 1,10 log IU / мл, P < 0.01). Кроме того, уровни HBsAg в сыворотке также значительно различались на 96 неделе между респондентами и нереспондентами HBeAg (2,75 ± 1,37 log МЕ / мл против 3,56 ± 0,51 log МЕ / мл, P <0,01). По сравнению с сывороточными уровнями РНК HBV сывороточные уровни HBsAg хорошо коррелировали с внутрипеченочными уровнями cccDNA через 96 недель после терапии NUC (r = 0,39, P <0,01). Предыдущие исследования также идентифицировали роль HBsAg в сыворотке крови в прогнозировании ответа на лечение во время лечения NUC, а более высокий уровень HBsAg в конце лечения NUC был независимым предиктором рецидива HBV после лечения (18–20), что решительно поддержало наши результаты, свидетельствующие о том, что сывороточные уровени HBsAg хорошо коррелируют с внутрипеченочными уровнями cccDNA и что уровни могут отражать активность cccDNA после обработки NUC.

Противовирусный механизм лекарств NUC в основном заключается в действии путем ингибирования обратной транскрипции (RT) pgRNA в ДНК HBV, и эти лекарства не оказывают прямого влияния на cccDNA и ее транскрипцию (22). Учитывая, что сывороточная РНК HBV, как было показано, транскрибируется внутрипеченочной cccDNA, лекарственные средства NUC могут, таким образом, оказывать более сильное ингибирующее действие на ДНК HBV, чем на РНК HBV. Таким образом, в нашем исследовании уровни ДНК HBV в сыворотке показали большее снижение, чем уровни РНК HBV в сыворотке после 96 недель терапии NUC (5,45 ± 1,49 log МЕ / мл против 2,82 ± 1,47 log МЕ / мл, P <0,01)

В заключение, при мониторинге противовирусной терапии для пациентов с ХГБ, избегая повторных инвазивных и потенциально опасных биопсий для получения образцов печени, допустимы простые измерения в сыворотке как уровней ДНК, так и РНК HBV, но из них, возможно, уровень ДНК HBV более информативным. И все же результаты этих двух анализов не всегда совпадают, и связи этих анализов с биопсийными анализами на cccDNA не всегда коррелируют. Таким образом, вопрос о клинической значимости сывороточной РНК HBV может быть сложным, и необходимы дальнейшие исследования, чтобы выявить его роль в процессе и патогенезе инфекции HBV.

Исследование 2

https://virologyj.biomedcentral.com/art ... 018-0994-7
Высокие уровни прегеномной РНК в сыворотке крови отражают частую неудачную обратную транскрипцию в частицах вируса гепатита В

Хроническая инфекция вирусом гепатита В (ВГВ) может вызвать воспаление и привести к циррозу печени и гепатоцеллюлярной карциноме (ГЦК) [1]. Риск развития этих осложнений выше, если высокая степень репликации вируса сохраняется и после 30–40 лет. Соответственно, количественная оценка ДНК HBV в сыворотке крови является основным маркером для прогнозирования риска цирроза и ГЦК [2], а уровни ДНК HBV также измеряются для мониторинга ответа на противовирусное лечение [1]. Во время лечения аналогом нуклеозида ДНК ВГВ обычно вскоре снижается до низкого или необнаружимого уровня в сыворотке. После этого количественное определение ДНК HBV не дает никаких указаний на то, уменьшает ли лечение количество инфицированных гепатоцитов или количество ковалентно замкнутых кольцевых (cccDNA) копий в этих клетках и, следовательно, количественное определение поверхностного антигена гепатита B (HBsAg) [3,4, 5] и недавно РНК HBV [6, 7] появились в качестве дополнительных маркеров для продолжающейся репликации HBV.

Эпизома cccDNA HBV в ядре инфицированных гепатоцитов транскрибируется в несколько мРНК во время репликации вируса. Один из этих транскриптов, прегеномная РНК (pgRNA), транскрибируется обратно в ДНК HBV вирусной полимеразой во время образования новых вирусных капсидов в цитоплазме гепатоцитов перед высвобождением оболочечных вирионов, но частицы, содержащие РНК HBV, также могут быть обнаружен в сыворотке крови [8]. Потенциальная диагностическая ценность количественного определения РНК HBV в сыворотке была предложена в нескольких исследованиях из Японии 10 лет назад [9], но не была установлена ​​в клинической диагностике. Клинический интерес к этому анализу был восстановлен двумя недавними исследованиями, в которых предлагалось количественное определение РНК HBV в качестве дополнения к ДНК HBV для мониторинга терапевтических эффектов [6, 7]. Поскольку аналоги нуклеозидов действуют на обратную транскрипцию, препарат не должен непосредственно влиять на уровни РНК HBV, но снижение РНК HBV должно скорее отражать косвенный эффект лечения, включая влияние на количество cccDNA или скорость транскрипции. Результаты упомянутых исследований показали, что РНК HBV в сыворотке содержалась в вирусоподобных частицах, что уровни РНК HBV и ДНК HBV в сыворотке коррелировали и что уровни РНК HBV снижались меньше, чем ДНК HBV во время противовирусного лечения, но значительно больше, чем Уровни HBsAg.

РНК HBV в сыворотке присутствовала в частицах с такими же свойствами, как вирионы HBV

Чтобы увидеть, присутствует ли РНК HBV в сыворотке в частицах, амплификацию проводили с применением расщепления РНКазой, примененной либо непосредственно к сыворотке, либо после экстракции нуклеиновой кислоты в приборе MagNA Pure (т.е. после лизиса вирусных оболочек и капсидов).[/b] Обработка РНКазой, примененная до экстракции нуклеиновой кислоты, не оказала существенного влияния (значение Ct увеличилось на 0,3 цикла), тогда как обработка РНКазой после экстракции нуклеиновой кислотой удалила почти всю РНК HBV. Эти результаты свидетельствуют о том, что в сыворотке практически не было свободно циркулирующей РНК HBV. Репрезентативный пример эффекта обработки ДНКазой и РНКазой показан в таблице 2. Значение Ct увеличилось на 12 циклов, что указывает на то, что ДНКаза и РНКаза разлагают более 99,9% ДНК HBV и РНК HBV соответственно. Этот пример от HBeAg-положительного пациента также показывает, что уровни ДНК HBV и РНК HBV могут быть одинаковой величины.

Чтобы дополнительно охарактеризовать частицы РНК HBV, образец сыворотки фракционировали на градиенте Nycodenz и анализировали на вирусную ДНК, РНК и HBsAg. Как показано на рис. 2, фракции показали, что HBsAg и вирусная ДНК / РНК были хорошо разделены, демонстрируя, что градиент имел достаточное разрешение для отделения вирусных частиц от субвирусных частиц по аналогии с предыдущими сообщениями [13, 14]. Распределение вирусной РНК во фракциях было практически идентично распределению вирусной ДНК (рис. 2а), что позволяет предположить, что два разных типа нуклеиновых кислот действительно были обнаружены в частицах с одинаковой плотностью. Чтобы убедиться, что пики ДНК и РНК соответствуют оболочечным вирусным частицам, образец сыворотки обрабатывали моющим средством перед центрифугированием в градиенте Найкоденца. Обработка детергентом привела к расширению пика как ДНК, так и РНК в сторону более высокой концентрации Nycodenz (Fig. 2b), вероятно, отражая появление частиц вируса без оболочки. Таким образом, эксперименты с РНКазой и градиентом предполагают, что вирусная РНК связана с частицами вируса в оболочке, которые похожи на частицы, содержащие вирусную ДНК.

Демонстрация того, что РНК HBV была обнаружена в частицах, напоминающих частицы инфекционного вируса, предполагает, что pgRNA была капсидирована, но не подверглась обратной транскрипции. Чтобы исследовать, присутствовали ли мутации, которые могли бы повлиять на обратную транскрипцию, в последовательности эпсилон (ε), был секвенирован 5'-конец РНК HBV из трех образцов, представляющих генотипы B-D. Не было обнаружено никаких мутаций, влияющих на структуру эпсилон-петли или прайминг полимеразы (рис. 3). Идентификация 5'-части РНК HBV после обратной транскрипции с обратным праймером, специфичным для поли-A-хвоста, указывает на то, что связанная с частицей РНК HBV в сыворотке представляет весь геном HBV.

РНК до ВГВ присутствовала в сыворотке

Чтобы исследовать, была ли полноразмерная РНК HBV в сыворотке только прегеномной РНК (pgRNA), или если присутствовала также прекорпоральная РНК, мы использовали два анализа цифровой ПЦР, которые различают два транскрипта. Эти анализы были применены к образцам сыворотки и ткани печени от 5 пациентов. Как показано на фиг. 5, концентрация pgRNA в ткани печени была в 30 раз выше (1,5 log10 единиц), чем в предшествующей РНК. В сыворотке уровни pgRNA были в 200 раз выше (2,3 log10 единиц), чем уровни предшествующей РНК. Более высокое соотношение в сыворотке, чем в ткани печени, соответствует в 6,6 раза более эффективному капсидированию pgRNA, чем в предшествующей РНК.

обсуждение

В этом исследовании мы проанализировали РНК HBV в сыворотке от пациентов с хронической инфекцией вирусом. Была выявлена сильная корреляция между вирусной РНК и ДНК, и на их связь влиял генотип HBV. Градиентное фракционирование и обработка РНКазой предполагают, что РНК HBV в сыворотке присутствует в частицах, которые напоминают инфекционные частицы, несущие вирусную ДНК. Секвенирование 5'-эпсилоновой части РНК не выявило каких-либо мутаций, которые могли бы объяснить отсутствие обратной транскрипции. В образцах сыворотки была идентифицирована не только pgRNA, но и preore RNA.

Сывороточные уровни РНК HBV в нашем исследовании были почти такими же высокими, как уровни ДНК HBV. В предыдущих исследованиях уровни РНК были на 0,8-2,8 log ниже, чем уровни ДНК [6, 7, 15]. Мы полагаем, что количественная связь между РНК ВГВ и ДНК ВГВ, наблюдаемая в нашем исследовании, является точной, поскольку мы использовали один и тот же образец экстрагированной нуклеиновой кислоты для обоих анализов, которые были выполнены параллельно с использованием одних и тех же праймеров и зондов для ДНК и РНК. Чтобы гарантировать, что анализ РНК не амплифицирует ДНК, мы предварительно обработали экстрагированные нуклеиновые кислоты ДНКазой и провели анализ ПЦР параллельно без фермента обратной транскриптазы. Таким образом, мы убедились, что высокие уровни РНК HBV не были связаны с амплификацией ДНК HBV (ДНКаза имела эффективность> 99%). Стратегия использования одних и тех же праймеров и зондов и параллельной амплификации ДНК и РНК, вероятно, способствовала сильной корреляции между уровнями ДНК HBV и РНК HBV с R2, равным 0,82. Эта корреляция была более сильной, чем между РНК HBV в ткани печени и сыворотке, что позволяет предположить, что секреция вирусных частиц, содержащих РНК HBV, в кровь тесно связана с секрецией зрелых вирусных частиц и менее характерна для внутриклеточных уровней РНК HBV.

////

[smilla]

Про РНК, cccDNA, кореляцию кол. HBsAg с активностью cccDNA в курсе. Интересно про диагностику через РНК. Но я не на столько любознательна, чтоб в это вникать. Мне кажется, что это представляет чисто академический интерес, по крайней мере для нас, пациентов. Жаль, что не может отписаться Марат - он бы расставил точки над и. Даже не знаю, кто бы еще мог прояснить ситуацю.

[Alekc22]

smilla,
Лена, а почему Марат не может? Что с ним?

[Костян40]

Даже не знаю, кто бы еще мог прояснить ситуацю

ну как кто. Скоро объявится

[Костян40]

smilla,
Лена, а почему Марат не может? Что с ним?

Аккаунт его удалён Решил, наверно, немного отойти от этой всей ситуации.

[Alekc22]

Решил, наверно, немного отойти от этой всей ситуации.

Здоровья ему и удачи!!!!

[Scrooge805]

Моих знаний не достаточно для понимания всей этой кухни,

Насколько я понял когда Марат и Марсианчик меня учили, Днк вируса (двухцепочная), находится внутри капсида, когда они плавают в крови. Когда HBsAg прицепляется к клеткам печени, и поскольку клетки печени постоянно находятся в активном состоянии, где то рушатся где то восстанавливаются, с ними и происходит клеточная репарация с починкой разорванных нитей днк. Имено в этот момент кажется прицепленный hbs ag при помощи чего то запускает свой вирусный днк в разорванную нить оригинального днк, и клетка восстанавливается уже с вставленным вирусным днк (там походу нуклеотиды будут другими, аденин, гуанин, тимин, цитозин, и между ними кусочек нити hbv dna. Ну и дальше по сценарию, днк внутри клетки превращается в замкнутую кольцевую, а это уже вызовет сигнал к иммунке. Но некоторые нити вируса видимо не успевают прицепится к востанавоивающимся клеткам и калитка закрывается, и они остаются снаружи в крови.

Так что определение hbv dna методом реал тайм пцр -это количество свободно плавающих днк В КРОВИ, без капсида.

Вот почему не одинаково количество hbs ag и hbv dna, может я ошибаюсь